L’observation des entités intra-cellulaires est essentielle pour élaborer et étudier de nouvelles solutions thérapeutiques aux différentes maladies pour lesquelles la mise au point de traitements curatifs reste un des défis de notre époque (maladie d’Alzheimer, cancers, etc.). Pour ce faire, la microscopie de fluorescence est une technique particulièrement puissante car elle permet d’imager spécifiquement les entités intra-cellulaires d’intérêt. Toutefois, la résolution spatiale en microscopie de fluorescence est limitée par la diffraction. Celle-ci, principal défaut des techniques d’imagerie en champ lointain, empêche de distinguer des détails séparés d’une distance inférieure à 200 nm transversalement et 600 nm axialement. Il est donc à priori impossible d’observer des protéines individuelles situées dans un même volume focal, ce qui crée un biais dans les résultats des expériences de co-localisation. Pour remédier à ces problèmes de résolution et passer de la microscopie à la nanoscopie de fluorescence (on parle aussi de super-résolution), il faut mettre en œuvre des stratégies qui s’appuient également sur les propriétés photophysiques des fluorophores, qui ne sont plus seulement de simples rapporteurs de position des entités cellulaires mais également la clé du gain en résolution. Dans le cadre de ces travaux de thèse de doctorat, un dispositif de nanoscopie de détection et super-localisation de molécules uniques a été premièrement mis en place. Celui-ci a permis l’observation d’entités intra-cellulaires avec une résolution transversale environ dix fois supérieure à la résolution optique conventionnelle.

Dans un deuxième temps, en plus d’exploiter les propriétés photophysiques des fluorophores, nous avons tiré parti des propriétés d’émission des fluorophores situés à proximité de l’interface entre l’échantillon et la lamelle afin de super-localiser leur position axiale absolue par rapport à cette interface avec une précision nanométrique. Cette nouvelle stratégie de nanoscopie 3D, appelée Direct Optical Nanoscopy with Axially Localized Detection (DONALD) permet d’observer les entités intra-cellulaires avec une super-résolution 3D quasi-isotrope. Enfin, le caractère absolu de la mesure axiale de la stratégie de nanoscopie DONALD a permis de caractériser, pour la première fois, l’architecture moléculaire 3D des podosomes, les structures d’adhérence responsables de la motilité cellulaire des macrophages humains. Ces résultats devraient aider les chercheurs à élaborer des solutions pharmacologiques ciblant les podosomes, afin de ralentir la motilité des macrophages souvent néfastes en cas de cancer solide, sans provoquer d’effets secondaires sur d’autres cellules.