En substituant l’illumination uniforme de l’échantillon classiquement utilisée, par une illumination structurée variant rapidement au cours de temps, l’émission de fluorescence des molécules est alors modulée temporellement, et révèle intrinsèquement la position de chacune des molécules. Cette technique appelée ModLoc pour « Modulated Localization », permet d’atteindre des précisions axiales proches de la taille des biomolécules (6.8 nm). Les développements en microscopie optique dite de super-résolution (récompensée par le prix Nobel de chimie en 2014) visent à pouvoir reproduire de façon fidèle l’organisation en 3D des protéines localisées à plusieurs dizaines de micromètres dans des échantillons complexes. En introduisant ce paramètre d’observation temporelle, les chercheurs ont pu montrer que la technique ModLoc permettait d’atteindre une résolution uniforme jusqu’à plusieurs dizaines de microns, alors que pour l’ensemble des techniques jusque-là proposées, la résolution variait avec la profondeur d’observation, de plus le champ d’observation proposé reste compatible avec les applications biologiques visées. ModLoc peut s’implémenter sur tout microscope optique et ouvre ainsi de nouvelles perspectives pour la biologie fondamentale ou le diagnostic médical, où le besoin de comprendre la localisation en 3D de molécules est un enjeu majeur de la recherche d’aujourd’hui. Protégé par un brevet CNRS, ce nouveau concept permettant d’extraire un paramètre de l’échantillon avec une précision constante à l’échelle nanométrique, peut se décliner pour l’observation d’autres informations que la position des molécules, et a d’ores et déjà fait l’objet d’une étude de valorisation.

a) Principe de la microscopie ModLoc : L’introduction d’une excitation structurée et modulée dans le temps permet d’extraire précisément la localisation des molécules fluorescentes à l’échelle nanométrique suivant l’axe z. L’échantillon biologique est excité via des franges d’interférences inclinées directement créeent dans l’échantillon et qui induisent une émission de fluorescence modulée. La mesure de la phase du signal modulé associée à chaque molécule fluorescente permet de retrouver sa position dans le champ d’observation. La détection permettant la démodulation est basée sur un module intégrant une cellule pockels associée à une caméra qui permet d’obtenir les 4 mesures d’intensité nécessaires au calcul de la phase et qui sont synchronisées aux quatre positions des franges d’interférences sur l’échantillon. b) Image super-résolue en 3D de mitochondries localisées à 6 µm à l’intérieur de cellules COS7 où la position suivant z (axe optique) est représentée en fausse couleur et obtenue avec une précision sous les 7 nm. C) zoom sur la région d’intérêt.

Publication sur le site de Nature :
Jouchet, P., Cabriel, C., Bourg, N. et al. Nanometric axial localization of single fluorescent molecules with modulated excitation. Nat. Photonics (2021). https://doi.org/10.1038/s41566-020-00749-9

Lecture en accès libre