Imagerie à super-résolution plein champ basée sur un signal de fluorescence modulé dans le temps

La microscopie à fluorescence est devenue le principal outil d’imagerie dans la recherche biologique. En raison de sa capacité à imager spécifiquement la structure biologique d’intérêt dans les cellules vivantes, la technique est inestimable pour de nombreuses tâches, en particulier en biologie cellulaire et moléculaire. L’invention de la microscopie à fluorescence à super-résolution il y a environ 20 ans permet maintenant la localisation de molécules uniques dans l’échantillon bien en dessous de la limite de diffraction, qui a longtemps été considérée comme une restriction absolue et insurmontable de la microscopie optique. Ces dernières années, des nouvelles techniques ont été introduites dans le domaine en utilisant des motifs d’éclairage structurés, atteignant ainsi des précisions de localisation nettement inférieures à 5 nm. Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode de microscopie de fluorescence super-résolue utilisant un éclairage structuré modulé dans le temps, qui permet de déterminer les positions des émetteurs dans l’échantillon uniquement en fonction du nombre de photons émis dans le temps. Il est important de noter que la procédure de localisation ne dépend donc pas d’une caméra en tant que dispositif d’acquisition, mais ne nécessite qu’un seul module de comptage de photons. En même temps, la technique maintient une capacité d’imagerie à plein champ. Cela se traduit par une résolution temporelle nettement plus élevée par rapport aux techniques basées sur la caméra, tandis qu’une résolution spatiale comparable est obtenue. Cette nouvelle méthode a reçu le nom de TimeLoc, abréviation de ’Time-modulation Localization’. Après la mise en œuvre
expérimentale, la fonctionnalité de la technique a d’abord été évaluée sur des billes fluorescentes en tant que qu’objet de calibration brillants, donnant des signaux d’émission avec un nombre de photons importants et facilement modulable . Les résultats expérimentaux ont ainsi montré que la mise en œuvre donnée atteint la limite de résolution théorique de la technique. Plus récemment, des expériences ont été menées sur des échantillons biologiques, où la reconstruction d’image du réseau de microtubules dans les cellules COS7 a été réalisée, démontrant ainsi la détection flurophores individuelles emettant en régime de molécules uniques. Une perspective prometteuse pour TimeLoc est de le combiner avec des approches résolues en temps (Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)), qui fournit des informations sur le microenvironnement chimique dans l’échantillon. Étant donné que FLIM nécessite un dispositif de détection rapide, TimeLoc serait particulièrement bien adapté pour détecter simultanément les positions des émetteurs dans l’échantillon.